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添加葡萄糖对大鼠生长动力学及NMN产生的影响

发布时间:Mar 24, 2021         已有 人浏览
大肠杆菌从生命技术公司购买DH5α,基因型F−Φ80拉茨ZΔM 15Δ(拉茨兹亚-阿格(F)U 169雷克A1端部A1HSDR17(rk−,mk+)phoA 苏普E 44λ−蒂伊-1 久尔A96雷尔A1λ-用于质粒克隆和长期保存。E. 大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS从Agilent购买,基因型B、F− DCM ompT hsdS(RB−甲基溴−) 高尔λ(DE3)[pLysS凸轮]r]进行蛋白表达。
 
蛋白表达载体
重组烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)基因从Novagen中克隆到pET-28a(+)表达载体中,在t7控制下表达。拉茨启动子35。三个这样的质粒,携带着对应于图中每个氨基酸序列的表达DNA。1所获得的NAMPT-PET28a载体含有NAMPT基因。[医]肌肉菌株C57BL/6J,是DR的礼物。Cynthia Wolberger(Addgene质粒#25630)是在E. 大肠杆菌DH5α,并维持在−80°C.pET28a-hdNadV和pET28a-soNadV质粒上,携带与nadV基因相对应的核苷酸序列。杜雷嗜血杆菌(菌株:ATCC 27722)[医]雪旺氏菌(菌株:mr-1)构建如下:从GenBank数据库中筛选出基因序列(分别为2716561,1169740),并对其表达进行优化。E. 大肠杆菌(使用Genome Compiler软件v.2.2.55(Genome Compiler Corporation 2015),考虑密码子使用频率和GC含量,消除不必要的限制序列)德雷沃(GenScript)连接到PET-28a(+)载体上,先用NcoI和XhoI限制性内切酶双酶切。所得到的质粒被化学转化为有能力的E. 大肠杆菌DH5α.在琼脂平板上筛选转化的卡那霉素(Km)耐药菌。对于pET28a-soNadV质粒,由于技术原因,有一个NcoI酶(5‘C)的限制性位点。▼加入CATGG 3‘),不影响酶活性。
 
将PCR基因序列(基因ID:HQ 636460.1)与GenScript合成的L135I突变体(CTC至ATA)连接,连接到pUC 57-kan质粒的NcoI/XbaI限制性位点,获得pUC 57-PRS质粒。
 
为了同时表达NAMPT和PRPP合成酶,通过PCR扩增pUC 57-kan质粒中的baPrs序列(q5高Fidelity 2X主序列,neb),用M13正向引物和反向引物,用xbai和ncoi限制性内切酶(Neb)双酶切PCR产物和pET28a-hdNadv质粒,分离出所需的DNA片段,以实现NAMPT和PRPP合成酶的同时表达。44,从凝胶(使用巫师SV凝胶和PCR清洁系统,Promega,麦迪逊,美国)的目的带(pET28a-hdNadV和baPrs)进行纯化,然后与T4 DNA连接酶(NEB)连接(如图所示)。4)。结果表明,双顺反子载体pET28a-baPrs-hdNadV在ID#91950下的Addgene上表达。
 
用1.5%琼脂糖凝胶电泳和T7正、反向引物PCR扩增证实载体的存在(附图)。S2)。克隆并转化到表达菌株中。E. 大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS表达NAMPT酶。PET28a-soNadV和pET28a-hdNadV载体分别保存在ID#83363#83362下的Addgene上。
 
细菌生长条件
为了进行质粒克隆、重组蛋白表达的初步评价、生长培养基中耐受性NAM浓度的测定、蛋白质诱导和细胞密度的优化,细菌在37°C的摇瓶(250 Rpm)中,在Leria-Bertani(LB)培养基中生长。45质粒维持用抗生素(表达载体为卡那霉素50μg/mL,pLysS质粒为25μg/mL氯霉素)。以细胞密度记录细菌生长动力学,用Jasco 530分光光度计测量600 nm光散射。
 
添加葡萄糖对大鼠生长动力学及NMN产生的影响E. 大肠杆菌BL 21(DE3)pLysS与pET28a-hdNadV、pET15b-PRS 135(Zakataeva N.、Ajinomoto-Genetika Research Institute-agri、莫斯科、俄罗斯)和pET28a-hdNadV(或pET28a-bas-Prs-hdNadV载体)通过将细菌细胞接种到500 mL水平生物反应器系统中进行鉴定。细胞在含0.1%或1%NAM和1%葡萄糖的LB培养基和PYA 8培养基(1.61%Na)中培养。2HPO4;0.136%KH2阿宝4;0.05%NaCl;0.5%酵母膏;1%CH3库纳)。生长条件(37℃,OD)600采用开放源码Arduino软件的生物反应器系统,维持pH值7.0~7.2,转速150 rpm。将异丙基-1-硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)抽运至1mm的终浓度时,诱导蛋白表达。600以1%乳糖为诱导剂,达到0.7或自动诱导。每增加光密度0.1单位,从发酵液中收获1毫升。收集的样品在2200时离心5分钟。g。上清液和沉淀物(再悬浮于1mL水中)分别保存在−20°C,直到测定NMN产率和葡萄糖浓度。
 
对于NAM底物浓度的优化,E. 大肠杆菌用pET28a-baPrs-hdNadV质粒转化BL 21(DE3)pLysS细胞,在PYA 8培养基中加入1%乳糖和20种浓度(0,0.03,0.05,0.07,0.09,0.1,0.3,0.5,0.7,0.9,1.1,1.3,1.5,1.7,1.9,2.1,2.3,2.5,2.7,2.9%)培养基中培养,12小时后,在37°C摇床中,收集所有细胞,进行荧光NMN测定。
 
细菌细胞活力评价
乳酸脱氢酶(LDH)在发酵过程中的积累是用一种商用的试剂盒(TOX-7,Sigma)进行的,并按照制造商的指示进行
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